Page 114 - İBG 2021 Faaliyet Raporu

(H2052 ve H2452) ve bir adet normal ya da tümörigenik olmayan sağlıklı mezotelyal hücre hattı (MeT-5A) kullanılacaktır. İlk olarak, bu hücre hatlarında normal koşullardaki ATG9A ifade seviyelerine western-blot ve real-time qPCR analizleri ile bakılmıştır. Daha sonra, MeT-5A, H2052 ve H2452 hücre hatlarında ATG9A ifadesi CRISPR/Cas9 hedeflemesiyle susturulacaktır. Bu amaçla ilgili hücreler Cas9 ve gRNA ifade eden ve HEK293T hücrelerinde virüs paketlemesi yapılan lentivirüslerle enfekte edilecektir. CRISPR/Cas9 müdahalesiileATG9Aifadeseviyelerideğiştirilmiş hücrelerde, çeşitli fenotipik çalışmaların yanında moleküler mekanizmalar da incelenecektir. Hücre proliferasyon yanıtı Senesans-ilişkili-beta- galaktozidaz (SABG) boyaması, BrdU işaretleme, hücre döngüsü, sferoid vekoloni oluşturma kapasitesi çalışmalarıyla gösterilecektir. Ayrıca, sağkalım yanıtı da apoptoz ve otofaji yolakları yönünden araştırılacaktır. Bu doğrultuda, otofaji yönünden LC3B hücre içi lokalizasyonu için immünofloresan boyama ve lipidasyonu için western blot, apoptoz yönünden, Kesilmiş Kaspaz-3 ve Kesilmiş PARP ile western blot yapılacaktır.
gen ifade seviyesine western-blot ve real-time qPCR analizleri ile bakılacaktır. Daha sonra, bu hücre hatlarında RUVBL-1 ifadesi CRISPR- Cas9 hedeflemesiyle susturulacaktır. Bunun için öncelikle Doksisiklin ile muamele edildiğinde Cas9 ifadesi sağlayan indüklenebilir hücre klonları üretilecektir. Ardından, ilgili hücreler gRNA ifade eden ve HEK293T hücrelerinde virüs paketlemesi yapılan lentivirüslerle enfekte edilecektir. CRISPR-Cas9 müdahalesinden sonra RUVBL-1 ekspresyonu susturulmuş hücrelerde, çeşitli fenotipik çalışmalar yapılacak ve moleküler mekanizmalar incelenecektir. Bu mekanizmalar, hücre proliferasyon yanıtı, BrdU işaretleme, hücre döngüsü, Soft Agar ve koloni oluşturma kapasitesi çalışmalarıyla gösterilecektir. Hücrelerin migrasyon ve invazyon kapasiteleri ise, yara iyileşmesi deneyi ve invazyon testi ile gösterilecektir. Bunlara ek olarak, farmakolojik inhibisyonun hücre proliferasyonu üzerine etkilerine bakılacaktır. Bunun için RUVBL-1 inhibitörü ile IC50 (hücrelerin yarısını öldüren ve/veya çoğalmayı bloke eden inhibitör konsantrasyonu) değeri belirlenecek, koloni oluşturma kapasitesi ve BrdU işaretleme çalışmaları yapılacaktır.
RUVBL-1 Geninin
Mezotelyomadaki
Araştırılması: CRISPR/Cas9 tüm genom negatif- seçilim tarama yöntemiyle ilk kez İşlevsel Kanser Genomiği Laboratuvarı tarafından tanımlanan ve MPM karsinogenez sürecinde sağkalımla ilişkili olabileceği öngörülen RUVBL1’in MPM’deki moleküler rolü üzerine CRISPR- Cas9 aracılı genetik ablasyon ve farmakolojik inhibisyon temelli öncül in vitro araştırmalar gerçekleştirilecektir. Bu amaç doğrultusunda, epitel özellikli iki farklı MPM kanser hücre hattında (H2052 ve H2452) normal koşullardaki RUVBL-1
106 Faaliyetlere İlişkin Bilgi ve Değerlendirmeler
Malign Moleküler
Plevral Rolünün