Page 112 - İBG 2021 Faaliyet Raporu

hücre hattı için qPCR tekniği ile analiz edilmiştir. Hedef genlerde Malt1 yokluğunda kontrol grubuna göre azalma olduğu görülmüştür. Ayrıca NF-kB raportör sistemli hücre klonları oluşturulmuş ve NF-kB aktivasyonunun TGF- beta’ya bağlı artışı lusiferaz deneyleri ile her iki hücre hattında da gösterilmiştir. Aynı klonlarda yine Malt1 ifadelenmesi shRNA ile azaltılmış ve yine kontrole kıyasla Malt1’a bağlı raportör aktivitesinde düşüş olduğu tespit edilmiştir. NF- kB aktivasyonunu destekleyici olarak, bir NF-kB yolak elemanı olan p65’in TGF-beta verildiğinde Malt1’ın susturulduğu klonlarda kontrole kıyasla çekirdeğe taşınmadığını gösteren immunofloresan deneyi yapılmıştır. Bu proje şu anda bir yüksek lisans tezine dönüşmüştür ve 2019 yılında gerçekleşen bir konferansta sözlü sunuma konu olmuştur. Projede elde edilen veriler yayına hazırlanmaktadır ve tez öğrencisinin de bu dönem içerisinde mezuniyeti planlanmaktadır.
Hepatoselüler Kanserde Tgf-ß Tarafından İndüklenen Senesens Karşıtı Direnç Mekanizmalarının Tüm Genom Transkriptom Analizi ile Araştırılması: TÜBİTAK 3001 projesi ile desteklenen bu proje kapsamında, iyi diferansiye hepatosellüler kanser hücresi olan ve TGF-β muamelesine güçlü bir senesens yanıtı olan Huh7 hücre hattından uzun süreli TGF-β muamelesi ile elde edilen dirençli klonlardaki (Huh7-TR) senesens yanıtsızlığının moleküler mekanizmaları araştırılmaktadır. Geçtiğimiz yıl, RNA sekanslama ve biyoinformatik analizler aracılığı ile bu direnç mekanizmasında rol alabilecek potansiyel adaylar belirlenmiştir. 2020 yılında bu adaylar içinde ön plana çıkan MARK1, GRM8 ve PLA2G4A genlerinin Huh7- TR hücre hattında CRISPR aracılı susturulması
gerçekleştirilmiştir. Elde edilen klonlarda TGF-β varlığındaki senesens yanıtı çeşitli yöntemlerle incelenmektedir. Bu genlerin senesens direncindeki rolünü pekiştimek için de Huh7 hücre hattında yüksek ifade edilerek yanıtın azalıp azalmadığını incelemek planlanmış ve bu yönde de çalışmalara başlanmıştır. Bunlara ek olarak poliklonal yapıda olan gerek elde ediliş bakımından, gerek fenotipik olarak, gerekse TGF-β yanıtı olarak- Huh7-TR hücre hattından tek hücre klonları elde edilmiş ve bu 3 aday genin ifadeleri incelenmiş ve homojene yakın bir dağılım gözlenmiştir. Ayrıca önceki çalışmalardan yola çıkarak Smad3 fosforilasyonunun bozulması aracılığıyla oluşabileceği düşünülen bu direnci mekanistik olarak daha iyi açıklayabilmek için yine CRISPR aracılığıyla elde edilen Smad3 nakavt Huh7 klonlarında doğal fenotip Smad3 ve literatürde epitel-mezenkimal geçişi yönlendirdiği tanımlanmış bağlanma bölgesindeki aminoasitlerin fosforlandığı bir mutant form olan Smad3-EPSM’nin yüksek ekspresyonunun sağlanması ve senesens yanıtının incelenmesi planlanmaktadır. Bu bakımdan Smad3 nakavt klonlar elde edilmiş ve doğrulanmıştır. Projedeki gelişmeler 2020 itibarıyla iki poster ve bir sözlü sunum olarak sunulmuştur. Ayrıca proje konusuyla ilgili bir derleme makale yayımlanmış, bir diğeri ise hakem değerlendirmesindedir.
Uzun Süreli Stabil CHO-DG44 Hücre Kültürlerinde Konstitütif Promotörlerin Sistematik Karşılaştırılması: Bu proje, esasen, DEÜ-BAP programı tarafından desteklenmiştir. Bu destek ile proje başlatılmış ve pek çok ön veri üretilmiştir. Bu proje kapsamında rekombinant DNA teknolojisini kullanarak ilk olarak, çeşitli CHO hücrelerinde yüksek protein
104 Faaliyetlere İlişkin Bilgi ve Değerlendirmeler