Page 111 - İBG 2021 Faaliyet Raporu

yöntemlerinin yetersiz kalması nedeniyle kanser sürükleyici mekanizmaların ve yeni tedavi hedeflerinin aydınlatılmasına ihtiyaç vardır. Bu proje kapsamında tüm genom CRISPR- Cas9 taraması aracılığıyla mesane kanseri duyarlılıklarının tanımlanması planlanmıştır. Projede kasa-invaze olan ve kasa-invaze olmayan şekilde karakterize edilen iki kanser hücre hattı ve karşılaştırma amaçlı bir de SV40 ile transforme edilmiş üroepitel hücre hattı kullanılmıştır. Bir önceki dönemde, bu hücre hatlarında tüm genom çapında Brunello gRNA kütüphanesine dayanan CRISPR-Cas9 taramaların tamamlanmasının ardından sekanslamaya hazır multipleks NGS kütüphaneleri oluşturulmuş ve her bir hücre hattındaki gRNA dağılımlarını gösteren yeni nesil dizileme çalışmaları tamamlanarak tarama protokollerinin oldukça başarılı bir şekilde gerçekleştirildiği öncül biyoinformatik sonuçlarla gösterilmiş ve ilgili güvenilir sonuçların yeni proje destekleri için kullanılabileceği değerlendirilmiştir.
TGF-beta ve NF-kB Sinyal Yolaklarının Çapraz Konuşmasında Malt1 Parakaspazın Moleküler Rolü: TGF-beta sinyal yolağı tek başına veya birçok farklı yolak ile çapraz konuşma yaparak hücre kaderini etkilemektedir. TGF- beta yolağının hücre kaderini regüle ederken çapraz konuşma yaptığı yolaklardan bir tanesi NF-kB sinyal yolağıdır. TGF-beta sinyal yolağı bu çapraz konuşmaları sonucunda hücrelerin gen ekspresyon profillerini ve fenotiplerini etkilemektedir. Öncül verilerimize göre TGF- beta yolağının aktive olduğu durumlarda NF-kB yolağı tarafından regüle edildiği bilinen genlerin ifadelenmesinde artış görülmüştür. NF-kB yolağının dolaylı ve direkt olarak regülasyonunda yer alan birçok aracı faktörden bir tanesinin de
Malt1 parakaspaz olduğu bilinmektedir. Fakat TGF-beta ve NF-kB yolakları arasındaki çapraz konuşma mekanizmasındaki moleküler rolü bilinmemektedir. Proje ile bu iki yolak arasındaki çapraz konuşmada Malt1’ın nasıl bir rolü olduğu ve TGF-beta yolağının epitelyal-mezankimal geçiş ve senesens gibi iki ayrı fenotipe sebep olduğu iki farklı hücre hattında aydınlatılması amaçlanmaktadır. Öncelikle Malt1 pozitif ifadelenmesinin iki ayrı hücre hattında da TGF- beta’ya bağlı olduğu zamana ve doza bağlı hücre kültürü deneyleriyle gösterilmiştir. İki ayrı hücre hattında TGF-beta yolak elemanları olan Smad proteinlerinin shRNA ile susturulduğu hücre kültürü deneylerinde, ortamda TGF- beta varlığında Malt1 ifadelenmesinin hem protein hem de RNA seviyelerinde arttığı ve özellikle Smad3’e bağlı olarak regüle edildiği gösterilmiştir. Malt1’ın TGF-beta aracılığı ile ne şekilde regüle edildiğini aydınlatmak için shSmad deney sonuçlarını desteklemek amacıyla Smad3 proteininin CRISPR-Cas9- temelli nakavt ile susturulduğu iki ayrı klon grubu iki ayrı hücre hattında da oluşturulmuştur. Malt1 ifadelenmesinin Smad3 aktivitesine olan bağlılığı protein ve RNA seviyelerinde analiz edilmiştir. Bir transkripsiyon inhibitörü olan actinomycin D kullanılarak Malt1’ın TGF-beta yolağı tarafından transkripsiyonel seviyede regüle edildiği qPCR deneyi ile gösterilmiştir. Bunu takiben, farklı uzunluklarda Malt1 promotör bölgelerinin olduğu raportör vektörler kullanılarak Huh7 hücre hattında TGF-beta’ya bağlı promotör aktivitelerinin arttığı lusiferaz deneyleri ile gösterilmiştir. Bütün bunların yanında, her iki hücre hattında da Malt1 ifadelenmesinin shRNA ile düşürüldüğü klonlar oluşturulmuştur ve çeşitli NF-kB hedef genlerinin ifadelenmesi de her iki
Temel ve Translasyonel Araştırmalar Programı 103