Page 109 - İBG 2021 Faaliyet Raporu

EGFR-Mutant Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri’nde Birinci Basamak Osimertinib Tedavisinde Gelişen Edinsel Dirençte Epigenetik ve Transkripsiyonel Faktörlerin Rolünün Araştırılması: Bu proje TÜBİTAK ve ABD-NSF arasında ikili iş birliğine imkan tanıyan TÜBİTAK destekli bir proje ile desteklenmektedir. Bu projedeki özgün amaç, epigenetik ve transkripsiyonel regülatörlerin EGFR-mutant KHDAK’li hastaların birinci basamak Osimertinib direncindeki rolünün ve EGFR yolağı ile sentetik letal etkileşimlerinin incelenmesidir. Son 10 yıldır, seçici olarak mutant EGFR’yi hedefleyen ve seleflerine göre daha etkin üçüncü nesil inhibitörler geliştirilmektedir. Bunlar arasında Osimertinib, KHDAK hastalarının birinci basamak tedavisi için onaylanan ilk ve tek inhibitördür. Ne yazık ki, seleflerinde olduğu gibi, Osimertinib’e karşı da direnç gelişmektedir. Genetik direnç mekanizmaları iyi tanımlanmış olmakla beraber genetik olmayan direncin moleküler temelleri anlaşılamamıştır. Son yıllarda yapılan araştırmalar, epigenetik yeniden programlama ve transkripsiyonel plastisite ile ilaç direnci arasında güçlü bir nedensel ilişki olabileceğini göstermiştir. İlgili proje kapsamında nükleer proteinler, epigenetik düzenleyiciler ve transkripsiyon faktörleri yönünden zenginleştirilmiş bir “gRNA kütüphanesi” havuzu kullanarak yüksek verimli CRISPR-Cas9 tarama yaklaşımı kullanılmaktadır. Bu projede doz artış rejimi uygulayarak Osimertinib dirençli HCC827 hücre hattı modelleri geliştirilmiştir. Ön çalışmalarda HCC827 ve OsiR-HCC827 hücrelerinin Osimertinib duyarlılığındaki fark doğrulanmıştır. Buna ek olarak, hücrelerde TGF-beta ile stimüle edilen ve morfolojik olarak takip edilebilen EMT’nin Osimertinib direncinde
etkisi olabileceği gösterilmiştir. Osimertinib sonrası EGFR bağımlılığının kaybolduğu MTT canlılık ve koloni formasyon yöntemleri aracılı doğrulanmıştır. EGFR yolağının durumu, alt akış sinyallerinde ve alternatif sinyal yolaklarında gerçekleşen değişimler immunblot ve “Proteome Profiler” aracılı desteklenmiştir. Projedeki ikinci iş paketi özelinde Sabatini Lab Nükleer kütüphanesini referans alıp, genişletilmiş bir gRNA listesi ((≈ 41.000 gRNA) hazırlanmıştır. Bu süreçte güncel ve özgün gRNA havuzu Custom Array firması aracılı sentezlenmiş ve gRNA havuzu çoğaltılıp, Lenti-Guide puro omurgasına klonlamaiçinhazırhalegetirilmiştir.Kütüphanenin hazırlanması için “Circular Polymerase Extension Cloning (CPEC)” tekniğinden faydalanılmıştır. Sonrasında elde edilen ürünler ile Endura elektrokompetan bakteri büyük ölçek çoğaltma için transforme edilmiştir. Kütüphanemizde gRNA reprezentasyon tayini ve doğrulanması için derin dizileme/biyoinformatik analizlerden faydalanılmıştır. Projede Blastisidin seçilimi aracılı stabil Cas9 ifadesine sahip olan HCC827 atasal ve HCC827-OsiR hücreleri elde edilmiştir. Kalıcı Cas9 ifadesi immunoblot ve rekabet tayini (competition assay) aracılı doğrulanmıştır. Nükleer gRNA kütüphanesinden (CPEC aracılı elde edilmiş) yüksek hacimli virüs partikülü ürettikten sonra, transdüksiyon optimizasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. CRISPR tarama deneylerine geçmeden önce, öncelikli olarak küçük ölçekte MOI (multiplicity of infection), hemen ardından proje deney kurgusuna en yakın olabilecek büyük ölçekte transdüksiyon katsayısı hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. Uygun MOI değerleri belirlendikten sonra, Osimertinib varlığında ve yokluğunda CRISPR tarama deneyleri parental ve dirençli hücre grubunda
Temel ve Translasyonel Araştırmalar Programı 101