Page 113 - İBG 2021 Faaliyet Raporu

ifadesinde kullanılabilecek doğal viral, memeli ve endojen promotörlerin gücünü sistematik olarak karşılaştırmak için yeni bir hepsi-bir-arada (all-in-one) dual-promotör raportör sistemi tasarlanmıştır. Dual-promotör raportör sistemi, geçici transfeksiyona dayalı lüsiferaz bazlı testlerde tipik olarak gözlemlenen varyasyonları en aza indirmiş ve CHO hücrelerinde yüksek seviyelerde transgen ekspresyonu sağlayan güçlü düzenleyici elementleri tanımlamak için yararlı bir sistem olduğunu kanıtlamıştır. İlgili DEÜ-BAP projesi aynı zamanda bir yüksek lisans tezini finanse etmiş ve proje kapanış raporu kabul edilmiştir. Ek olarak, bu çalışmalardaki ön bulgulara dayanan bir TÜBİTAK 1002 projesi desteği alınmıştır. Devam projesi pandemi sebebiyle 2020 Haziran ayında başlatılabilmiştir. Kabul edilen TÜBİTAK 1002 projemiz, seçili konstraktların stabil CHO kültürlerindeki promotör gücünü karşılaştırmıştır. Çalışmada kullanılan CHO-DG44 hattı, dihidrofolat redüktaz (DHFR) enziminden yoksundur. Bilindiği gibi, DHFR enzimi, dihidrofolatın tetrahidrofolata indirgenmesini sağlayarak pirimidin ve pürinin üretiminden sorumludur. DHFR eksikliği gösteren hücreler sadece hipoksantin ve timidin (HT) içeren besiyerlerinde büyüyebilirler. DHFR içeren plazmid ile transfekte edilmiş olan CHO- DG44 hücreleri ise, HT içermeyen seleksiyon besiyerinde de büyüyebilirler. Böylelikle seçilim sonucu farklı promotör adaylarını içeren altı farklı stabil hücre elde edilmiştir. Ön çalışmalardan aday olarak görülen beş promotör stabil hücre hatlarında karşılaştırmak amacıyla, DHFR (açık okuma çerçevesi) ile birlikte vektöre klonlanmıştır. Aday promotör listesi CHEF1a, UBC, CAG, CMV ve SV40 promotörlerini içermektedir. Bu promotörler CHO-WT, CHO-DG44 adheran
ve CHO-DG44 süspanse hücrelerinde geçici transfeksiyon sonrası elde edilen Lusiferaz sonuçları doğrultusunda seçilmiştir. Stabil hücre hatları yaklaşık 40 gün seçilim sonunda elde edilmiştir. Sonrasında Lusiferaz ölçümü aracılı promotör aktiviteleri karşılaştırılmış, geçici transfeksiyon (transient transfection) sonuçlarına göre daha farklı bir promotör etkinlik sırası elde edilmiştir. RT-PCR aracılı Fluc (Firefly), Rluc (Renilla), DHFR ve GAPDH ifadeleri ölçülerek promotör aktiviteleri uzun süreli (stable) CHO-DG44 hücrelerinde karşılaştırılmış ve Lusiferaz sonuçları ile tutarlı olan bir promotör aktivite sıralaması elde edilmiştir. Sistematik karşılaştırmayı normalize etmek ve DHFR kopya sayısını belirlemek amacıyla DNA bazlı qPCR deneyleri gerçekleştirilmiştir. Son olarak, DHFR protein seviyelerinin belirlenmesini takiben proje kapanış raporu yazılmış ve kabul edilmiştir. Makale için istenilen revizyon çalışmalarının tamamlanmasını takiben yayının kabul edilmesi beklenmektedir.
Malign Plevral Mezotelyoma Hücrelerinin Sağkalımında ATG9A Geninin Hayati Rolü: Şentürk İşlevsel Kanser Genomiği Laboratuvarı’nda farklı MPM kanser hücre hatlarında gerçekleştirilen tüm genom CRISPR/ Cas9 tarama esasına dayanan moleküler çalışmalarda MPM karsinogenezinde hayati önem taşıma potansiyeli bulunan pek çok aday gen tanımlanmıştır. Hayatta kalma ile ilişkili bu aday genlerden birisi ATG9A genidir. ATG9A, preotofagosomal yapı/fagofor toplanma bölgesinin organizasyonunda önemli bir rol oynar. ATG9A daha önce kanserde tanımlanmış olup, göğüs ve hepatosellüler kanserlerinde ifade seviyesinde artış gözlemlenmiştir. Bu çalışmada, iki farklı MPM kanser hücre hattı
Temel ve Translasyonel Araştırmalar Programı 105