Page 136 - İBG 2021 Faaliyet Raporu

karışım olan H2A-H2B ve H3-H4, 2M NaCl (HFB) içeren diyaliz etken histon katlama tamponu ile katlanarak, dimerler ve oktamerlerin elde edilmesiyle boyut dışlama kromatografisiyle saflaştırılmıştır. DNA, EcoRV restriksiyon enzimi ile widom-601 konumlandırmasını içeren 12-mer’lik tekrar dizisini kesmesi sonucunda pGEMT easy vektörüne klonlanarak, 5%PAGE (cell prep) ile saflaştırılmıştır. Örneğin saflığı 1% agaroz jel ile analiz edilmiştir (Şekil 2A).
Nükleozom ve kromatozom yeniden yapılandırması, insan histonlarının, tetramerlerinin, dimerlerinin diyaliz edildiği ve belirli oranlarda karıştırıldığı bir takım deneysel prosedürlerde gerçekleştirilmiştir. Daha sonra, insan H1E-WT, nükleozom ve çekirdek histon oktamer karıştırılarak tuz çözeltisine karşı diyaliz edilmiştir. In vitro olarak oluşturulmuş nükleozomların ve kromatozomların yüksek kalitesi ve homojenliği Şekil 2 B, C’de gösterilmektedir. Ayrıca hidroksil radikal ayak izi ile de analiz edilmiştir (gösterilmemiştir).
Hücre kültürü: Rahman mutantı, HA etiketli Rahman mutantı, kuyruksuz H1E ve WT- HA etiketli Rahman model hücre hatları, S. Dimitrov’un ekibi tarafından sağlanmıştır. H2B’nin floresan PAGFP etiketli füzyonunu içeren foto aktive edilebilir floresan H2B-PAGFP yapılarının plazmitleri, Addgene (ABD) firmasından temin edilmiştir. WP2 ile ilgili, Sellou vd., 2016’daki çalışmasına benzer lazerle indüklenen DNA mikro hasarından sonra, kromatin dinamik deneyleri için fotoaktive edilebilir floresan çekirdek histonları H2B’yi ifade eden stabil hücre hattı üretmek için bu plazmitleri WT veya Rahman mutasyonlu hücre hatlarını birleştirmeye yönelik çalışmalara başlanmıştır.
Şekil 2. 197 bp 601 nükleozom konumlandırma dizisi (A), bağlayıcı histon H1E-WT (B) ve RH1E mutantı (C) ile nükleozom ve kromatozom yeniden yapılandırmalarını gösteren agaroz jel görüntüleri.
Oksidatif olarak üretilen DNA hasarları:
Oksitlenmiş pürin ve pirimidin bazları, zincirler arası baz çapraz bağları ve DNA-protein çapraz bağları oksidatif olarak üretilen DNA hasarının çeşitli sınıfları, 266 nm lazer ışınımına veya tek elektronlu oksidanlara maruz kalması üzerine hem izole edilmiş DNA’da hem de hücresel DNA’da üretildiği daha önce gösterilmiştir. Bu çalışma, sulu çözeltilerde çift sarmallı deoksioligonükleotitlerin yüksek yoğunluklu UVC lazer darbeli ışınlaması ile guanin bazlarının bifotonik iyonizasyonunun, zincirler arası çapraz bağların (ICLs) oluşumunu indüklediğine dair kanıt gösterilmiştir. Oluşan foto ürünlerin dizilimi jel analizleri ve UVC lazer yoğunluğunun bunların oluşumu üzerindeki etkileri çeşitli deneylerle desteklenmektedir. UVC lazer bifotonik iyonizasyonu, iyonizasyon
128 Faaliyetlere İlişkin Bilgi ve Değerlendirmeler