Page 114 - Faaliyet Raporu 2022

EGFR-Mutant Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri’nde Birinci Basamak Osimertinib Tedavisinde Gelişen Edinsel Dirençte Epigenetik ve Transkripsiyonel Faktörlerin Rolünün Araştırılması: Bu proje TÜBİTAK ve ABD-NSF arasında ikili iş birliğine imkân tanıyan TÜBİTAK destekli bir proje ile desteklenmektedir. Bu projedeki özgün amaç, epigenetik ve transkripsiyonel regülatörlerin EGFR-mutant KHDAK’li hastaların birinci basamak Osimertinib direncindeki rolünün ve EGFR yolağı ile sentetik letal etkileşimlerinin incelenmesidir. Son 10 yıldır, seçici olarak mutant EGFR’yi hedefleyen ve seleflerine göre daha etkin üçüncü nesil inhibitörler geliştirilmektedir. Bunlar arasında Osimertinib, KHDAK hastalarının birinci basamak tedavisi için onaylanan ilk ve tek inhibitördür. Ne yazık ki, seleflerinde olduğu gibi, Osimertinib’e karşı da direnç gelişmektedir. Genetik direnç mekanizmaları iyi tanımlanmış olmakla beraber genetik olmayan direncin moleküler temelleri anlaşılamamıştır. Son yıllarda yapılan araştırmalar, epigenetik yeniden programlama ve transkripsiyonel plastisite ile ilaç direnci arasında güçlü bir nedensel ilişki olabileceğini göstermiştir. İlgili proje kapsamında nükleer proteinler, epigenetik düzenleyiciler ve transkripsiyon faktörleri yönünden zenginleştirilmiş bir “gRNA kütüphanesi” havuzu kullanarak yüksek verimli CRISPR-Cas9 tarama yaklaşımı kullanılmıştır. Söz konusu tarama deneyleri doz artışı rejimi uygulayarak geliştirdiğimiz Osimertinib dirençli HCC827 hücre hattı (HCC827-OsiR) modellerinde gerçekleştirilmiştir. Osimertinib sonrası EGFR bağımlılığının kaybolduğu MTT canlılık ve koloni formasyon yöntemleri ile doğrulanmıştır. EGFR yolağının durumu, alt akış sinyallerinde ve alternatif sinyal yolaklarında
gerçekleşen değişimler ise western blotlama ve Proteome Profiler analizi aracılığıyla desteklenmiştir. Ayrıca parental ve Osimertinib dirençli hücrelerin RNA dizileme sonrası tüm genom transkriptom analizi gerçekleştirilmiştir. Örnekler arasında genel benzerlik PCA analizi ile gösterildikten sonra, Volcano plot ve diğer biyoinformatik çözümlemeler kullanılarak dirençli ve parental hücreler arasında anlamlı olarak artan/azalan genler tanımlanmış ve belli genlerin qRT-PCR aracılı validasyonu gerçekleştirilmiştir. CRISPR tarama çalışmaları özelinde ise, Sabatini Lab Nükleer kütüphanesi referans alınıp, genişletilmiş bir gRNA listesi (yaklaşık 41.000 gRNA) hazırlanmıştır. Custom Array firması tarafından sentezlenen özgün gRNA havuzu pLenti-Guide puro omurgasına klonlanmıştır. gRNA reprezentasyon tayini ve doğrulanması için NGS sonrası biyoinformatik analizlerden faydalanılmıştır. CRISPR tarama deneyleri parental ve dirençli hücre grubunda (Osimertinib yokluğunda ve varlığında) yaklaşık bir ay süre ile gerçekleştirilmiştir. Biyoinformatik çözümlemeler kullanılarak elde edilen CRISPR tarama verileri değerlendirildiğinde, EGFR yolağı ile sentetik lethal etkileşime sahip olan genlerin bir listesi oluşturulmuştur. Bu noktada, Osimertinib varlığında – yokluğuna göre – anlamlı olarak daha düşük CRISPR skoru üreten genlerin önceliklendirilmesine önem gösterilmiştir. Yapılan validasyon çalışmalarına göre, FOSL1 ve JUN transkripsiyon faktörlerinin EGFR yolağı ile sentetik letal etkileşimi olabileceği bulgulanmıştır. Devam eden çalışmalarda, hücre döngüsü, apoptoz ve senesans gibi hücresel mekanizmaların ilgili fenotiplere etkisi de araştırılmaktadır. Ayrıca söz konusu letal etkileşimin moleküler mekanizmaları EGFR
Temel ve Translasyonel Araştırmalar Programı 107