Page 123 - Faaliyet Raporu 2022

yetenekleri test edilmiştir. Bu hücrelerden elde edilen RNA örneklerinden çeşitli EMT belirteçlerinin analizleri gerçekleştirilmiştir. c-Met inhibisyonunun IR izoform spesifik etkilerini gen ekspresyonu düzeyinde belirlemek amacıyla RNASeq çalışması gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmadan elde edilen verilerin biyoinformatik analizi Karakülah Lab ortaklığı ile sürmüştür. Ayrıca IR izoform spesifik c-Met etkileşiminin in siliko modelleme çalışmaları Karaca Lab tarafından yapılmıştır. Tamamladığımız bu projeden elde edilen veriler ile makale yazım çalışmaları proje ortağımız Dr. Desbois-Mouthon ile birlikte yürütülmektedir.
Karaciğer Kanserinin Tedavisinde Yeni Bir Strateji: c-Met Reseptör Tirozin Kinaz Proteinindeki Nedilasyon Bozukluklarının Küçük Moleküller İle İnhibisyonu (Proje Yürütücüsü: Neşe Atabey, ABD Ekibi Yürütücüsü: Aykut Üren, Araştırmacılar: Ezgi Karaca, Burcu Kaplan Türköz, Gülçin Çakan Akdoğan, Doktora Sonrası Araştırmacı Yeliz Yılmaz, TÜSEB Yenilikçi İlaç Geliştirme Stratejik ARGE çağrısı, 6860, 2021-2023): Bir post-translasyonel modifikasyon olan nedilasyon, NEDD8 proteininin hedef proteinlerdeki lizin amino asitlerine kovalent bağ ile eklenmesi sonucu gerçekleşir ve HCC’de genel nedilasyon mekanizmasının önemli bir rol oynadığı daha önce belirlenmiştir. Atabey Kanser Biyolojisi ve Sinyal İletimi Laboratuvarı’nda gerçekleştirilen ve henüz yayınlanmamış çalışmalarda ise c-Met’in nedilasyon hedeflerinden birisi olduğu ilk kez gösterilmiştir. Spesifik c-Met inhibitörü ve nedilasyon inhibitörünün birlikte kullanımının c-Met aktivasyonunu, HCC hücre proliferasyonunu ve migrasyonunu önemli
ölçüde baskıladığı belirlenmiştir. Bu projede ise öncelikle HCC’de c-Met’in nedilasyon mekanizması aydınlatılması, haha sonra yapılacak küçük molekül kütüphanesi taramaları ile HCC hücrelerinde nedile olan c-Met’i hedef alan bir inhibitörün belirlenmesi hedeflenmiştir. Buyolla öncelikli olarak tümör hücrelerinde artan nedile c-Met’i hedefleyen daha etkin, yan etkileri daha düşük hedeflenmiş bir tedavi stratejisinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Proje kasamında nedile c-Met’in üç boyutlu yapısının SAXS ölçümleri ile belirlenmesine yönelik çalışmalar için EMBL-Hamburg’da yer alan Petra III BIO-SAXS sistemi kullanılmıştır. Ege Üniversitesi’nden Kaplan-Türköz Lab. ortaklığı ile c-Met kinaz domainini içeren His-c-Met ve His-NEDD8 proteinleri IPTG indüksiyonu sonrası yüksek miktarlarda üretilmiş ve izole edilmiştir. Daha sonra ultrafiltrasyon ile konsantre edilen örneklerin ileri düzeyde saflaştırılması SEC kromatografisi ile gerçekleştirilmiştir. Petra III ışık demetinde ayrı ayrı ve birlikte batch ve SEC- SAXS ölçümleri yapılan His-NEDD8 ve His-c-Met kinaz domain proteinlerinin zarf yapısı moleküler modelleme analizleri yapılmıştır ve iki proteinin birlikteliği değerlendirilmiştir. Gerçekleştirilen in siliko analizler sonucu c-Met’in potansiyel nedile olan lizinleri belirlenmiş, bu lizinlerin mutant formlarını kodlayan c-Met plazmidleri hazırlanmıştır. WT ve nedilasyon bölgesi mutantlarının HEK293 ve HCC hücrelerine aktarılması sonrasında mekanistik ve biyolojik analizler yapılmış, WB yöntemiyle alt yolak elemanlarının aktivasyonu değerlendirilmiş, NEDD8 ve c-Met proteinlerinin birlikte immünçöktürülmesiyle c-Met mutantlarının nedilasyonu incelenmiştir. Ayrıca WT ve nedilasyon mutantı c-Met eksprese eden veya
116 Faaliyetlere İlişkin Bilgi ve Değerlendirmeler