Page 143 - Faaliyet Raporu 2022

ve kısaltılmış TRRS H1E hücre ekstraktlarında, 8-oxoG, AbaS ve Etheno için BER aktivitesinde bir miktar uyarım gözlemlenmiştir, glikollerde değişiklik görülmemiştir ve NER (Siklobütan pirimidin dimerleri CPD’ler) aktivitesinde çok küçük bir artış gözlemlenmiştir. Beklendiği gibi, onarımın artması homozigotlar için heterozigotlardan daha önemlidir. Beklenen transkriptom verileriyle birlikte eksizyon BER ve çift sarmal kopması (DSBR) onarımı üzerinde Glyco-SPOT ve Next-SPOT analizleriyle devam eden deneyler, ek bilgi ve mekanistik bir kavrayış sağlayacaktır.
Şekil 3.A. Her bir 6-lezyonlu plazmidin, yani 8-oxodG (8oxoG), abazik bölgelerin (AbaS), timin glikollerin (Glikoller), eteno modifiye nükleositlerin (Etheno) Bağıl Floresan Yoğunluğu FI (ortalama+/-SD) ), cis-platin eklentileri (CisP), siklobüten pirimidin dimerleri ve 6-4 fotoürünler (CPD+64), modifiye edilmemiş plazmitin arka plan floresanından arındırılmıştır. 3 örnek dışında, Cisplatin eklentisinin onarımının ölçülebilir olmadığına dikkat edilmelidir. B. Mutasyona uğramış hücre ekstraktlarının onarım kapasitesini temsil eden bağıl floresan yoğunluğu, WT hücre ekstraktlarını kontrol etmek için normalize
edilmiştir
• Hedefleme vektör yapıları ve floresan hücre hatları kültürleri (WP2 ile ilgili): Amacımız, lazerle indüklenen mikro hasarı takiben H1 değişim dinamikleri (FRAP) ve DNA hasar yanıtının (DDR) floresan mikroskopisi çalışmasında kullanmak için hem fotoaktifleştirilebilir floresan etiketli H2B hem de H1E histonlarını eksprese eden WT ve RS mES hedefleme vektörleri ve hücre hatları üretmekti.
• Öncelikle, PATagRFP (Fotoaktifleştirilebilir RFP) ile etiketlenmiş insan H2B’yi stabil bir şekilde eksprese eden mESC’ler oluşturuldu ve genotipleme ile, H2B-PATagRFP fragmanının hücrenin genomuna rastgele entegre edildiği gösterildi. Bir sonraki adım, H1E’nin 5’ ucuna PAGFP (Photoactivable GFP) parçasının eklenmesiyle PAGFP-H1E hedefleme vektörünün oluşturulmasıydı. Hedefleme vektörleri, endojen fare H1E’yi 1) PAGFP ile etiketlenmiş insan wild type H1E, 2) PAGFP ile etiketlenmiş Rahman H1E veya 3) PAGFP ile etiketlenmiş kesilmiş Rahman H1E ile değiştirmek üzere tasarlanmıştır. Sekanslama sonuçları, hedefleme vektörlerinin mükemmel bir şekilde eşleştiğini göstermiştir. Oluşturulan hedefleme vektörleri, insan H2B- PATagRFP’sini kararlı bir şekilde eksprese eden mESC hücre hatlarını transfekte etmek için
136 Faaliyetlere İlişkin Bilgi ve Değerlendirmeler