Page 144 - Faaliyet Raporu 2022

Şekil 2. PAGFP-H1E (A) ve H2B-PATagRFP (B) cDNA amplifikasyonu. M: 100bp ladder. B6 BLU: Wild type mESC. H2B klonu: orijinal klon, PATagRFP ile etiketlenmiş insan H2B’yi eksprese eder. WW: Homozigot klondan wild type H1E. Ww: Heterozigot klondan wild type H1E. RR: Homozigot klondan Rahman H1E. Rr: Heterozigot klondan Rahman H1E. TT: Homozigot klondan kısaltılmış H1E. Tt: Heterozigot klondan kısaltılmış H1E. (C) western blot üzerinde PAGFP-H1E
kullanılmış ve uygun homo- ve heterozigot klonları toplanıp ve PCR ile genotiplenmiştir. Klonlar, tam inhibitörlü 2i ortamında kültürlenerek ve oluşturulan klonlarda PAGFP-H1E ve (Şekil 2B) H2B-PATagRFP (Şekil 2A) ekspresyonu ile amplifiye edilmiş, fragmanlar, cre sistemi ile muamele edilen klonlardan PCR ile amplifiye edilmiştir. PAGFP-H1E proteinleri, bir anti-GFP antikoru (Şekil 2C) kullanılarak western a blot tarafından doğrulanmıştır.
• İn vitro onarım deneyleri için kromatinize substratların yapımı: WT veya RS H1E bağlayıcı histon içindeki WT ve RS H1E hücre hatlarından saflaştırılmış UNG veya hücresel ekstraktların onarım (BER) kapasitesini in vitro yeniden yapılandırılmış nükleozom dizisinde araştırmak için PCR amplifikasyon-klonlama-ligasyonu veya nickase stratejileri aracılığıyla, WT veya RS H1E bağlayıcı histon içeren ve farklı konumlarda tek bir urasil ikamesi taşıyan bir dizi di- ve 12-mer
Temel ve Translasyonel Araştırmalar Programı 137