Page 117 - Faaliyet Raporu 2022

genom CRISPR/Cas9 taraması kütüphanesinden hayati önem taşıma potansiyeli bulunan ARMC7, MARS2, SCD, EARS2, GFM1, PTPMT1 genleri ileri çalışmalar için seçilmiştir. Bu validasyon çalışmasından elde edilecek sonuçlar dahilinde, TÜBİTAK 1001 Programına başvurulmak üzere proje hazırlanmaktadır. Söz konusu çalışmalar bir yüksek lisans tezi kapsamında gerçekleştirilmektedir.
TGF-beta ve NF-kB Sinyal Yolaklarının Çapraz Konuşmasında Malt1 Parakaspazın Moleküler Rolü: TGF-beta sinyal yolağı tek başına veya birçok farklı yolak ile çapraz konuşma yaparak hücre kaderini etkilemektedir. TGF- beta yolağının hücre kaderini regüle ederken çapraz konuşma yaptığı yolaklardan bir tanesi NF-kB sinyal yolağıdır. TGF-beta sinyal yolağı bu çapraz konuşmaları sonucunda hücrelerin gen ekspresyon profillerini ve fenotiplerini etkilemektedir. Öncül verilerimize göre TGF- beta yolağının aktive olduğu durumlarda NF-kB yolağı tarafından regüle edildiği bilinen genlerin ifadelenmesinde artış görülmüştür. NF-kB yolağının dolaylı ve direkt olarak regülasyonunda yer alan birçok aracı faktörden bir tanesinin de Malt1 parakaspaz olduğu bilinmektedir. Fakat TGF-beta ve NF-kB yolakları arasındaki çapraz konuşma mekanizmasındaki moleküler rolü bilinmemektedir. Proje ile bu iki yolak arasındaki çapraz konuşmada Malt1’ın nasıl bir rolü olduğu ve TGF-beta yolağının epitelyal-mezankimal geçiş ve senesens gibi iki ayrı fenotipe sebep olduğu iki farklı hücre hattında aydınlatılması amaçlanmaktadır. Öncelikle Malt1 pozitif ifadelenmesinin iki ayrı hücre hattında da TGF- beta’ya bağlı olduğu zamana ve doza bağlı hücre kültürü deneyleriyle gösterilmiştir. İki ayrı
hücre hattında TGF-beta yolak elemanları olan Smad proteinlerinin shRNA ile susturulduğu hücre kültürü deneylerinde, ortamda TGF- beta varlığında Malt1 ifadelenmesinin hem protein hem de RNA seviyelerinde arttığı ve özellikle Smad3’e bağlı olarak regüle edildiği gösterilmiştir. Malt1’ın TGF-beta aracılığı ile ne şekilde regüle edildiğini aydınlatmak için shSmad deney sonuçlarını desteklemek amacıyla Smad3 proteininin CRISPR-Cas9- temelli nakavt ile susturulduğu iki ayrı klon grubu iki ayrı hücre hattında da oluşturulmuştur. Malt1 ifadelenmesinin Smad3 aktivitesine olan bağlılığı protein ve RNA seviyelerinde analiz edilmiştir. Bir transkripsiyon inhibitörü olan actinomycin D kullanılarak Malt1’ın TGF-beta yolağı tarafından transkripsiyonel seviyede regüle edildiği qPCR deneyi ile gösterilmiştir. Bunu takiben, farklı uzunluklarda Malt1 promotör bölgelerinin olduğu raportör vektörler kullanılarak Huh7 hücre hattında TGF-beta’ya bağlı promotör aktivitelerinin arttığı lusiferaz deneyleri ile gösterilmiştir. Bütün bunların yanında, her iki hücre hattında da Malt1 ifadelenmesinin shRNA ile düşürüldüğü klonlar oluşturulmuştur ve çeşitli NF-kB hedef genlerinin ifadelenmesi de her iki hücre hattı için qPCR tekniği ile analiz edilmiştir. Hedef genlerde Malt1 yokluğunda kontrol grubuna göre azalma olduğu görülmüştür. Ayrıca NF-kB raportör sistemli hücre klonları oluşturulmuş ve NF-kB aktivasyonunun TGF- beta’ya bağlı artışı lusiferaz deneyleri ile her iki hücre hattında da gösterilmiştir. Aynı klonlarda yine Malt1 ifadelenmesi shRNA ile azaltılmış ve yine kontrole kıyasla Malt1’a bağlı raportör aktivitesinde düşüş olduğu tespit edilmiştir. NF-kB aktivasyonunu destekleyici olarak, bir NF-kB yolak elemanı olan p65’in TGF-beta
110 Faaliyetlere İlişkin Bilgi ve Değerlendirmeler